Связывание комплемента. Реакция связывания комплемента (рск)

Страница 33 из 91

Реакция связывания комплемента (РСК)
Соединение антитела с антигеном и комплементом не обязательно сопровождается разрушением антигена. Это. в большей степени относится к микробам, которые проявляют устойчивость к литическому действию комплемента. Происходящее в таких случаях связывание комплемента может быть выявлено непрямым путем с помощью метода, открытого Ж. Борде и С. Жангу. Сущность метода заключается в следующем. При взаимодействии иммунной сыворотки со специфическим антигеном происходит соединение антигена с антителом, образуется комплекс антитела с антигеном, который связывает комплемент. В случае несоответствия антигена и антитела связывания комплемента не происходит, т. е. комплемент остается свободным. Процесс связывания комплемента при положительной реакции антитела с антигеном остается невидимым. Поэтому для определения, связался ли комплемент или остался свободным, в качестве индикатора в реакцию вводится гемолитическая система (гемолитическая сыворотка - гемолизины и эритроциты барана). Реакция связывания комплемента ставится в две фазы: в первой фазе к исследуемой сыворотке (антителу) добавляется антиген и комплемент, во второй - добавляется гемолитическая система.
Если в первой фазе реакции исследуемая сыворотка содержит специфические для антигена антитела, то комплемент будет связан с комплексом антиген+антитело, при добавлении гемолитической системы гемолиз не произойдет и реакция будет считаться положительной.
Если же исследуемая сыворотка не содержит специфических антител, т. е. антиген и антитела не соответствуют друг другу, тогда комплемент в первой фазе реакции остается свободным и при добавлении гемолитической системы произойдет гемолиз (растворение) эритроцитов, т. е. реакция будет отрицательной (см. рис. 57).
Реакция Борде-Жангу (реакция связывания комплемента), обладающая высокой чувствительностью, приобрела большое диагностическое значение. Это значение еще больше увеличилось, когда Жангу показал, что реакция может происходить не только с бактериальными телами, но и с их экстрактами. Реакция Борде-Жангу применяется при диагностике сапа, гонореи и других заболеваний. А. Вассерман, исходя из идеи Ж. Борде, применил реакцию связывания комплемента для серодиагностики, сифилиса. Эта реакция получила практическое применение в распознавании сифилиса.
Реакция связывания комплемента применяется с двоякой целью:

1. Для обнаружения в сыворотке специфических антител с помощью известного антигена. Например, имея антиген, приготовленный из культуры гонококка, можно обнаружить гонококковые антитела в сыворотке больного. В этом случае необходимо пользоваться антигеном, доза которого, связывающая комплемент, заранее вытитрована на значительном количестве сывороток больных.
2. Для определения вида антигена при помощи сыворотки, содержащей антитела к определенному антигену. Например, при помощи соответствующей иммунной сыворотки можно идентифицировать палочку коклюша. В этих случаях необходимо иметь сильную иммунную сыворотку, титр которой известен.

Ингредиенты (составные части) реакции. Для реакции связывания комплеме-нта необходимы следующие ингредиенты: 1) эритроциты барана, 2) гемолитическая сыворотка, 3) комплемент, 4) антиген и 5) испытуемая сыворотка.
1. Эритроциты получают из дефибрин ированной крови барана. Для этого у барана берут кровь из яремной вены непосредственно в банку со стеклянными бусами. Встряхивают в течение 10 минут. Процеживают через стерильную марлю, центрифугируют и сыворотку отсасывают. Три раза отмывают эритроциты от остатка сыворотки физиологическим раствором хлористого натрия центрифугированием в течение 10-15 минут. После третьего центрифугирования из осадка приготовляют 3% взвесь эритроцитов для опыта. При хранении в леднике дефибринированная кровь может употребляться в течение 6-8 дней.

Схема приготовления разведений гемолитической сыворотки из основного разведения 1: 100

1. Гемолитическая сыворотка обычно получается от кроликов, иммунизированных эритроцитами барана. Гемолитическую сыворотку выпускают в сухом виде институты бактерийных препаратов. На этикетке ампулы указан титр сыворотки и срок годности.

Таблица 4
Схема титрования гемолитической сыворотки

Титром гемолитической сыворотки называется ее предельное разведение, способное в объеме 0,5 мл растворить 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов в присутствии 0,5 мл комплемента в течение часа при температуре 37°.
Титр гемолитической сыворотки определяется по следующей схеме: приготовляют основное разведение выворотки 1: 100 (0,1 мл сыворотки+0,9 мл физиологического раствора), из которого готовят дальнейшие разведения (табл. 3).
В ряд пробирок последовательно отмеривают по 0,5 мл полученных разведений гемолитической сыворотки, начиная с 1: 1000, добавляют в каждую пробирку по 0,5 мл комплемента, разведенного 1:10, и по 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов. Титрование гемолитической сыворотки проводится по схеме (табл. 4).
Из схемы видно, что данная сыворотка еще в разведении 1: 1500 дает полный гемолиз (т. е. титр сыворотки 1: 1500). В дальнейшем для опыта берут в 3 раза меньшее разведение (тройной титр). Так, например, если титр гемолитической сыворотки 1: 1500, применяется разведение 1:500 (т. е. 0,1 мл сыворотки 49,9 мл физиологического раствора).

1. Комплемент. В качестве комплемента в реакции служит сыворотка морских свинок (их комплемент обладает наибольшей активностью) или сухой комплемент, выпускаемый институтами бактерийных препаратов.

Так как степень активности комплемента не у всех морских свинок одинакова, необходимо брать кровь у нескольких животных и полученные сыворотки смешивать.
Титром комплемента обозначается первая минимальная доза комплемента, растворяющая эритроциты. Если, например, в приведенной схеме титрования полный гемолиз произошел в пробирке, содержащей 0,3 мл комплемента, и неполный гемолиз оказался в пробирке, содержащей 0,25 мл комплемента, то титром комплемента надо считать 0,3 мл в разведении 1: 10. В качестве рабочей дозы комплемента обычно берется титр его, увеличенный на 20-25%, т. е. приблизительно это соответствует тому количеству комплемента, которое содержится в предпоследней пробирке с гемолизом.
Как при титровании гемолитической сыворотки, так и при титровании комплемента ставятся два контроля (см. табл. 5).

Схема титрования комплемента без антигена


Таблица 6
Схема титрования комплемента в присутствии антигена

Кроме того, рекомендуется титровать комплемент также в присутствии антигена.
Титрование комплемента в присутствии антигена необходимо в тех случаях, когда антиген подавляет титр комплемента (антикомплементарное свойство антигена). Это свойство может зависеть как от природы самого антигена, так и от способа его приготовления.

1. Антиген. В реакции связывания комплемента используются различные антигены. Антигенами являются культуры разнообразных микробов или экстракты патологически измененных или нормальных тканей. В качестве бактериального антигена могут употребляться как взвеси микробов в физиологическом растворе, так и экстракты из микробов, приготовленные различными способами (например, антиформиновый гонококковый антиген, спиртовой туберкулезный и т. п.). Хорошими антигенными свойствами обладает микробная взвесь, предварительно убитая парами формалина или обработанная алкоголем. Для реакции исходную взвесь антигена разводят по оптическому стандарту, содержащему. 1 млрд. микробных тел в 1 мл, и берут в объеме 0,5 мл.

В качестве антигена применяют также микробные лизаты в дистиллированной воде или физиологическом растворе, полученные в шюттель-аппарате (аппарат для встряхивания) или путем обработки антиформином.
Для реакции следует употреблять такую дозу антигена, которая вызывает полную задержку гемолиза с сыворотками, содержащими соответствующие гемолизины, но которая сама по себе задержки гемолиза не дает. В силу того, что все микробные антигены адсорбируют какое-то количество комплемента, перед титрованием их проверяют на антикомплементарные свойства, определяя растворяющую дозу комплемента, т. е. то наибольшее количество антигена, которое не вызывает задержки гемолиза. Определение такой растворяющей дозы антигена производится по схеме (табл. 7).
Из таблицы видно, что в данном примере растворяющая доза антигена составляет 0,4 мл. Для опыта берут половину такой дозы, т. е. ориентировочная доза будет равна 0,2 мл.

1. Испытуемая сыворотка. Сыворотку больного отделяют от сгустка через 3-48 часов после взятия крови и инактивируют в водяной бане при 56° в течение 30 минут.

Таблица 7 Схема определения растворяющей дозы антигена

Инактивированные сыворотки могут сохраняться в холодильнике в течение 5-6 дней. Для реакции сыворотка больного применяется в разведении 1:5 (0,1 мл сыворотки+0,4 мл физиологического раствора).
Постановка опыта реакции связывания комплемента (табл. 8).
Для постановки реакции связывания комплемента необходимы следующие ингредиенты:

1. физиологический раствор (0,85%);
2. сыворотка, подлежащая исследованию, инактивированная при 56° в течение 30 минут в водяной бане;
3. антиген (взвесь бактерий или экстракт из них), не вызывающий самостоятельно ни гемолиза, ни задержки его в дозе, установленной титрованием;
4. комплемент в рабочей дозе, установленной титрованием;
5. гемолитическая сыворотка в дозе, соответствующей ее утроенному титру;
6. 3% взвесь бараньих эритроцитов.

Каждый из ингредиентов, который применяется для реакции, берется в количестве 0,5 мл. Если доза отдельного компонента меньше этого объема, то ее дополняют физиологическим раствором до 0,5 мл.
Основной опыт связывания комплемента желательно ставить сразу с двумя - тремя антигенами, приготовленными различным способом (А1, А2, А3 в табл. 8).

Схема основного опыта

Для контроля необходимо одновременно ставить реакцию точно в тех же условиях с нормальной сывороткой и сывороткой, заведомо дающей положительный результат. При постановке реакции сначала смешивают исследуемую сыворотку, антиген и комплемент. Смесь выдерживают при 37° в течение часа. По истечении указанного срока в пробирку добавляют смесь гемолитической сыворотки и эритроцитов - гемолитическую систему. Гемолитическую систему добавляют или непосредственно после приготовления смеси из равных объемов гемолитической сыворотки и эритроцитов, или после получасового выдерживания этой смеси в термостате. Смесь всех ингредиентов после энергичного встряхивания помещают в термостат при 37° на 1 час, а затем на 12 часов переносят в холодильник или оставляют при комнатной температуре.
В пробирках, в которых произошел гемолиз, жидкость становится прозрачной, но окрашенной (см. рис. 58).

Рис. 58. Схема реакции связывания комплемента.
а - реакция положительная; б - реакция отрицательная.

Результат реакции обозначается или словами «положительная», «отрицательная» реакция, или знаком плюс (+) или минус (-). Но так как степень задержки гемолиза может колебаться в пределах от полной задержки до очень слабой, обозначения могут быть следующие:
(++ + +)-полная задержка гемолиза; жидкость не окрашена, значительный осадок эритроцитов;
(+ + +) -ясная задержка гемолиза; жидкость окрашена, осадок эритроцитов;
(++)-частичная задержка гемолиза; жидкость окрашена интенсивно; компактный осадок эритроцитов;
(+)-очень слабая задержка гемолиза; жидкость окрашена интенсивно, осадок небольшой;
(±) -следы задержки гемолиза, при взбалтывании заметен незначительный осадок;
(-)-полный гемолиз (отрицательная реакция).

РСК широко используют для лабораторной диагностики венерических болезней, риккетсиозов, вирусных инфекций. Реакция протекает в две фазы. Первая фаза - взаимодействие антигена и антител при обязательном участии комплемента. Вторая - выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка). Разрушение эритроцитов гемолитической сывороткой происходит только в случае присоединения комплемента к гемолитической системе. Если же комплемент адсорбировался ранее на комплексе антиген-антитело, то гемолиз эритроцитов не наступает. При наличии в исследуемой сыворотке антител , комплементарных антигену, образующийся комплекс антиген-антитело связывает (адсорбирует) на себе комплемент. При добавлении гемолитической системы гемолиза не происходит (задержка гемолиза ) , т.к. весь комплемент израсходован на специфическую связь комплекса антиген-антитело, а эритроциты остались неизменными. При отсутствии в сыворотке антител , комплементарных антигену, специфический комплекс антиген-антитело не образуется и комплемент остается не связанным. Поэтому при добавлении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней. Результатом реакции в данном случае будет гемолиз эритроцитов - в пробирках образуется так называемая «лаковая» кровь.

Рис. 6. Схема РСК: а - индикаторная система (эритроциты барана и антитела к ним) в присутствии комплемента определяется в виде гемолиза; б - с сывороткой больного диагностикум (Аг) образует иммунные комплексы и активирует комплемент, результат - задержка гемолиза; в - в сыворотке здорового человека антител нет, комплемент активируется индикаторной системой, результат - гемолиз.

Реакции с применением меченных ат и аг

Реакции с использованием меченных антител и антигенов составляют основу методов экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, так как выявляют минимальное содержание Аг и Ат в исследуемых образцах. В качестве меток могут быть использованы различные ферменты, красители флюорохромы и изотопы.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) Данный метод является экспрессным и высокочувствительным. Существуют две его разновидности. При прямом методе к исследуемой взвеси микробов, фиксированной на стекле, добавляют сыворотку, меченную флуорохромом. Образующийся комплекс антиген-антитело при освещении ультрафиолетовыми (сине-фиолетовыми) лучами дает ярко-зеленое свечение . При непрямом РИФ используют обычные диагностические сыворотки против какого-либо вида микробов. Добавление этой сыворотки к испытуемой взвеси микробов вызывает образование комплекса антиген-антитело. Этот комплекс выявляется с помощью универсальной флюоресцирующей сыворотки, содержащей антитела к гаммаглобулиновой фракции крови того вида животного, от которого была получена диагностическая сыворотка. Светящийся комплекс выявляют при люминесцентной микроскопии.

Рис. 7. Реакция иммунофлюоресценции (схема).

Иммуноферментный анализ (ИФА) В основе иммуноферментного анализа лежит известная иммунная реакция антигена и антитела. Один из этих реагентов является определяемым веществом, а другой - узнающим, обладающим известной стандартной специфичностью (избирательностью) по отношению к определяемому веществу. Для выявления образовавшихся иммунных комплексов (антиген-антитело) используется фермент , которым предварительно метится узнающий компонент (антиген или антитело). Сам фермент, естественно, не виден, поэтому визуализация присутствия вещества, определяемого методом ИФА, достигается применением посредника - хромогена . Это особое химическое соединение, которое хорошо растворимо в воде, и раствор которого бесцветен. Превращение бесцветного хромогена в цветное вещество хромофор происходит под действием фермента, для которого хромоген является субстратом.

Рис. 8. Иммуноферментный анализ (схема).

Аутоантигены - вещества, обладающие способностью вызывать иммунные реакции в организме, из которого они получены. Их содержат мозг, хрусталик глаза, сперматозоиды, паращитовидные железы, гомогенаты семенной железы, кожи, почек, печени и других тканей. Так как в обычных условиях аутоантигены не приходят в соприкосновение с иммунными системами организма, антитела к подобным клеткам и тканям не образуются. Однако при повреждении этих тканей аутоантигены могут всасываться и вызывать образование антител, оказывающих повреждающее действие на соот­ветствующие клетки. Аутоантигены могут возникать также из клеток некоторых органов и тканей под влиянием охлаждения, медикаментозного воздействия, вирусных инфекций, бактериальных бел­ков и токсинов, например стрептококков, стафилококков, микобактерии туберкулеза, и других факто­ров. Они образуются в этом случае вследствие нарушения видовой специфичности собственных антигенов организма.

Антитела, будучи сложными гликопротеидными молекулами, сами по себе также являются антигенами. В их составе различают три типа антигенных детерминантов (элитипов): изотипы, аллотипы и идиотипы.

Изотипы - детерминанты, по которым различаются классы и подклассы тяжелых цепей и вариан­ты каппа- и лямбда- легких цепей.

Аллотипы - детерминанты, кодируемые аллелями данного иммуноглобулинового гена.

Идиотипы - антигенные детерминанты, образуемые активными центрами молекул антител.

На долю класса IgG приходится около 75% общего количества всех иммуноглобулинов сыворотки крови человека.

Реакция разработана Ж. Борде и О. Жангу в 1901. Которые установили, что при образовании комплекса антиген – антитело происходит связывание им комплемента.

Образовавшееся соединение мелкодисперсно и не определяется визуально. Для выявления адсорбции (связывания) комплемента авторы применили индикаторную гемолитическую систему: эритроциты барана и гемолитическую сыворотку. Если в испытуемой системе антиген не соответствует антителу, иммунный комплекс не образуется, комплемент остаётся свободным. Комплемент адсорбируется только на комплексе антиген - антитело, отдельно на антигене или антителе он не адсорбируется. Поэтому при добавлении к испытуемой системе гемолитической системы, состоящей из уже готового комплекса антиген - антитело (эритроциты барана и антитела к ним), комплемент присоединяется к этому комплексу, вызывая гемолиз эритроцитов барана - видимый результат.

Реакция связывания комплемента (РСК) отличается высокой чувствительностью и специфичностью. РСК применяется в серодиагностике гонореи, сифилиса, коклюша, всех риккетсиозов, многих вирусных заболеваний. Как и другие серологические реакции, РСК можно применить и для серотипирования.

РСК - сложная серологическая реакция. В ней участвуют две системы антиген - антитело и комплемент.

Для постановки РСК необходимы:

Сложность реакции обуславливается количеством участвующих ингредиентов и, главным образом, необходимостью определять точные количественные соотношения их. Поэтому постановке основного опыта предшествует титрование её ингредиентов.

Гемолитическая сыворотка готовится в производственных условиях путем 3-4 кратной внутривенной иммунизации кролика 50 % взвесью бараньих эритроцитов и инактивируется при 56 °С в течение 30 мин. Для её титрования берутся последовательно уменьшающиеся дозы (1:1200, 1:1500, 1:1800, 1:2000, 1:2500), 3% взвесь эритроцитов, комплемент 1:10 в равных объёмах (но 0,5 мл). На этикетке ампул с гемолитической сывороткой обозначен её титр - максимальное разведение, которое обеспечивает полный лизис 3% взвеси эритроцитов барана в присутствии комплемента в течение часа при 37°С. Для РСК используют разведение сыворотки, увеличенное против титра в 3 раза.

Взвесь эритроцитов барана 3% получают из дефибринированной крови барана путем отмывания изотоническим раствором NaCl.

Комплемент - свежая сыворотка крови морской свинки или высушенная - титруется перед опытом: последовательно уменьшающиеся дозы (1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40) + гемолитическая система (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка). После инкубации в термостате при 37°С определяют титр комплемента - наибольшее разведение, которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки. Рабочая доза комплемента должна быть выше титра на 25%, т.к. активность комплемента в опыте может оказаться несколько подавленной другими комплементами реакции (антиген, сыворотка).

Антиген - взвесь убитых микроорганизмов, их лизаты, полные антигены, гаптены, экстракты тканевых липидов -иногда связывает комплемент даже в отсутствии иммунной сыворотки, поэтому его также необходимо оттитровать. Берутся последовательно уменьшающиеся дозы антигена + рабочая доза комплемента + гемолитическая система. Титром антигена является его наименьшая доза, при которой наступает отчётливый гемолиз. Для РСК берут дозу антигена, вдвое уменьшенную против титра во избежание связывания комплемента.

Исследуемая сыворотка перед опытом подвергается инактивированию при 56°С в течение 30 мин. Для инактивирования её собственного комплемента.

Все компоненты реакции связывания комплемента берутся в равных объёмах.

Постановка основного опыта.

После установления титра и рабочих доз всех ингредиентов ставят основной опыт РСК. В реакции участвует также титрованные сыворотки: заведомо здорового и заведомо больного (отрицательно и положительная сыворотки соответственно). Как и испытуемую сыворотку, контрольные - тоже инактивируют при 56°С в течение 30 мин.

РСК проводят в две фазы:

I фаза - специфическая - инкубация смеси антигена, антитела и комплемента в термостате при 37°С в течение 30 мин.

II фаза - индикаторная - определение наличия в смеси свободного комплемента путем добавления гемолитической системы (предварительно помешенной на 30 мин. в термостат) и инкубации в термостате при 37°С в течение 20 -30 мин.

Результаты опыта оценивают, отмечая наличие или отсутствие гемолиза во всех пробирках (см. табл.). Реакцию считают положительной при полной задержке гемолиза, когда жидкость в пробирке бесцветна и эритроциты оседают на дно, отрицательной, когда жидкость интенсивно окрашивается ("лаковая кровь"). Степень интенсивности гемолиза оценивают в зависимости от интенсивности окраски жидкости и величине осадка эритроцитов на дне (+ + + +, + + +, + +, +).

Учёт результатов РСК.

Учитывать результаты опыта (испытуемой сывороткой) можно лишь в том случае, если все контроля прошли правильно.

В пробирке №2 с положительной сывороткой (содержащей антитела к данному антигену) гемолиза не должно быть, т.к. комплемент связан в первой специфической системе, а гемолитическая система осталась без комплемента - эритроциты оседают на дно, надосадочная жидкость прозрачна.

В пробирке №3 с отрицательной сывороткой, сывороткой здорового человека, не содержащей антитела к данному антигену, гемолиз должен быть, поскольку в первой фазе реакции не произошло образование комплекса антиген -антитело (из - за отсутствия антител к данному антигену) и комплемент остался свободным. При добавлении гемосистемы во II фазе реакции комплемент адсорбировался на готовом иммунном комплексе эритроциты барана плюс антитела к ним; произошел лизис эритроцитов барана (гемолиз).

Наличие гемолиза в контроле сыворотки и антигена (пробирки №4 и 5) указывает, что их дозы были выбраны правильно и что сами по себе ни сыворотка, ни антиген комплемента не связывают. Оставшийся свободным в специфической системе комплемент адсорбируется иммунным комплексом гемолитической системы, происходит гемолиз.

Гемолиз в контроле комплемента (пробирка №6) свидетельствует об активности комплемента и правильности выбора его рабочей дозы.

В контроле гемолитической системы (пробирка №7) при правильной работе этой системы не должно быть даже следов гемолиза, т.к. в ней отсутствует комплемент.

При безупречных контрольных результатах можно учитывать опыт (пробирка №1). Отсутствие гемолиза расценивают как положительный результат. Он свидетельствует о том, что в испытуемой сыворотке обнаружены антитела к данному антигену (человек болен). При соответствии антигена антителу образуется комплекс антиген - антитело, который связывает комплемент (I фаза). При добавлении гемолитической системы гемолиза эритроцитов во II фазе не будет. Наличие гемолиза является отрицательным результатом, свидетельствующим об отсутствии антител к данному антигену (человек здоров). Комплемент остается свободным и при добавлении гемолитической системы присоединяется к комплексу эритроцит - гемолизины, вызывая гемолиз.

Реакция связывания комплемента (РСК) – сложная двухэтапная серологическая реакция. В ней используют пять ингредиентов, составля­ющих две системы: антиген, антитело, комплемент (первая система); эритроциты барана, сенсибилизированные (обработанные) гемолитической сывороткой, содержащей специфические к ним антитела (вторая, или индикаторная, гемсистема). При этом взаимодействие антитела с антигеном на первом этапе реакции приводит к образованию иммунного комплекса, который адсорбирует комплемент, но визуально обнаружить это невозможно. В качестве индикатора связывания комплемента на комплексе антиген–антитело на втором этапе используют гемсистему, кото­рая, являясь иммунным комплексом, тоже способна адсорбировать его. В конечном итоге возможны два вариан­та результата реакции. Если антитело и антиген соответствуют друг другу и комплемент адсорбируется образовав­шимся комплексом, лизиса эритроци­тов гемсистемы не произойдет. При несоответствии антитела антигену, и наоборот, комплемент, оставаясь сво­бодным, присоединится к гемсистеме и вызовет гемолиз.

Как и другие серологические ре­акции, РСК можно использовать для выявления специфических антител по известному антигену или для определе­ния антигена по известным антителам.

Общая характеристика ингредиен­тов РСК.

1. ИССЛЕДУЕМАЯ СЫВОРОТКА перед постановкой реакции прогрева­ется на водяной бане 30 мин для инактивации ее собственного комплемента и разводится начиная с 1:5.

2. АНТИГЕНОМ могут быть культуры бактерий, их лизаты, вирусы и вирус–содержащие материалы, экстракты па­тологически измененных органов и тканевые липиды.

3. КОМПЛЕМЕНТ – сыворотка мор­ских свинок, полученная в день опыта. В настоящее время используется производственный сухой комплемент.

4. ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА состоит из смешанных в равных объемах гемолитической сыворотки и 3% взвеси эритроцитов барана по осадку. Для сенсибилизации эритроцитов гемолизинами смесь выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 30 мин.

Постановка основного опыта РСК. В 1 пробирку вносят СЫВОРОТКУ, АНТИГЕН И КОМПЛЕМЕНТ, во вторую – сыворотку, комплемент и вместо антигена изотонический раствор натрия хлорида (КОНТРОЛЬ СЫВОРОТКИ), в третью – антиген, комплемент и тот же раствор натрия хлорида (КОНТРОЛЬ АНТИГЕНА). Пробирки ставят в термостат при температуре 37°С на 1ч. Одновременно готовят гемолитическую систему, которую затем добавляют во все три пробирки после извле­чения штатива из термостата. Смешав гемсистему с ингредиентами трех пробирок, последние вновь ставят в термостат на 1 ч, и спустя это время учитывают результаты РСК.

При учете РСК интенсивность реакции обозначается плюсами: «++++»– резко положительная реакция с полной задержкой гемолиза, жидкость в пробирке бесцветная, все эритроциты осели на дно; «+++», «++» –положительная реакция, отличается нарастанием окраски жид­кости вследствие гемолиза и уменьшения количества эритроцитов в осад­ке; «+» – слабоположительная реакция, жидкость интенсивно окрашена, на дне пробирки незначительное количество эритроцитов. Отрицательная реакция обозначается знаком «–», при этом наблюдается полный гемолиз, жидкость в пробирке имеет интенсивно–розовую окраску («лаковая кровь»).

РСК – весьма сложная, но очень чувствительная специфическая реакция. Широко применяется в диагностике сифилиса, хронической формы гонореи, коклюша, актиномикоза, всех риккетсиозов и вирусных инфекций.

Иммуноферментный анализ.

Метод был разработан в начале 70-х гг независимо друг от друга тремя группами учёных. Метод напоминает РИА, но в его основу положено маркирование Аг или Ат, вступающего в реакцию, ферментом. Взд метки с субстратом обычно сопровождается изменением окраски среды. В настоящее время созданы многочисленные модификации этого метода, но наибольшее распространение получил гетерогенный ИФА на твёрдой фазе (твердофазный). Различают:

1) ПРЯМОЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИФА. В этом случае:

1. сыворотку с Ат инкубируют с Аг, фиксированным на твёрдом субстрате (чаще всего это пластиковая микропланшетка).

2. Ат, не связавшие Аг, удаляют многократным промыванием.

3. Вносят меченную ферментом сыворотку к Ат, связавшим Аг.

4. Определяют ко-во фермента–маркёра, связавшегося с Ат.

2) КОНКУРЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИФА.

1. Вносят сыворотку. Если в ней есть специфические Ат, то они связываются с Аг, фиксированном на твёрдом субстрате. Если специфических Ат нет, то Аг оказывается не связанным.

2. При добавлении специфических к фиксированному Аг Антител в первом случае им будет не с чем взаимодействовать (большинство Аг уже связаны) Þ содержание маркёра низкое. Во втором случае специфические Ат будут связываться с Аг и при отмывании они не будут смываться Þ высокое содержание маркёра.

Аналогично м.б. фиксированы АНТИТЕЛА, и различные фирмы выпускают именно планшеты с уже фиксированными Ат.

По сравнению с классическими методами выявления Аг этот метод позволяет непосредственно регистрировать их взаимодействие с Ат, а не вторичные проявления (агглютинацию, преципитацию или гемолиз). Метод очень ЧУВСТВИТЕЛЕН (достаточно концентрации 1нг/мл).

Определяют: Хламидии, клостридии, ВИЧ и др.

8. Реакция фагоцитоза.

Фагоцитоз осущ-ся микрофагами и макрофагами. Стадии фагоцитоза: приближение, прилипание, погружение, переваривание.

Оценка функциональной активности фагоцитирующих клеток.

Колич. оценку фагоцитарной активности гранулоцитов и моноцитов производят в цельной крови, в лейкоцитарной взвеси или в обогащенных фракциях фагоцитирующих клеток. В качестве стандартных объектов фагоцитоза используют монодисперсные частицы латекса диаметром 1,0-2,0 мкм, суспензию убитых нагреванием бактерий или дрожжеподобных грибов.

Фагоциты смешивают с фагоцитируемым материалом в соотношении 1:10 или 1:100 и инкубируют при 37°С в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Затем пробирки центрифугируют и осадок ресуспензируют в капле сыворотки крови для приготовления мазка. В мазках, фиксированных краской Май-Чрюнвальда и окрашенных по Романовскому-Гимзе, подсчитывают процент фагоцитирующих клеток (ФП – фагоцитарный показатель) и кол-во поглощенных частиц на 1 клетку (ФЧ – фагоцитарное число).

У здорового человека ФП=40-80%, ФЧ=1-5.

9. Диагностикумы.

Диагностикумы – это взвесь убитых нагреванием или формалином определенных микробных клеток с известным содержанием клеток в единице объема. В качестве антигена могут быть использованы также взвеси живых бактерий. Феномен реакции проявляется предварительно через два часа (при 37 0 С), окончательный результат учитывается при комнатной температуре через 18-20 часов. Для диагностики представляет интерес положительная реакция только в опре-деленном титре сыворотки, который служит диагностическим. Так, при бруцеллезе диагностический титр 1:200, а при туля-ремии -1:100. Для выявления антител можно ставить экспрессные реак-ции агглютинации (время учета несколько минут). Например: 1. Кровяно-капельная реакция при туляремии. В каплю цельной крови больного на специальном стекле наносят кап-лю дистиллированной воды (для гемолиза) и каплю туляре-мийного диагностикума. Реакция происходит в течение 1-2 минут, хорошо видны агглютинаты в виде белесых комочков. 2. На стекле проводится экспрессная реакция агглютина-ции по Хеддельсону при бруцеллезе.

Данные реакции не позволяют определить количество ан-тител в сыворотке.б) для идентификации чистой культуры возбудителей ин-фекционных болезней. С этой целью используются иммунные диагностические

агглютинирующие сыворотки, выпускаемые институтамивакцин и сывороток, путем иммунизации животных целымимикробными клетками. Для достоверности сыворотки лучше использовать адсор-бированные, чтобы в них содержались только антитела, соот-ветствующие определенному виду или типу микроорганизма.

Принципы получения иммунных сывороток.

Иммунная сыворотка (антисыворотка) представляет собой сыворотку крови, содержащую антитела к данному антигену. В большинстве случаев иммунные (диагностические) сыворотки к микробным, тканевым и другим антигенам получают экспериментальным путем, иммунизируя животных соответствующими антигенами.

В числе основных требований, предъявляемых к антисывороткам, - их высокая специфичность и достаточное содержание антител. По специфичности различают поливалентные (полиспецифические) и моновалентные (моноспецифические) антисыворотки. Поливалентные сыворотки содержат антитела ко многим антигенам, моноспецифические - к одному конкретному антигену. Получить моноспецифические сыворотки можно:

1) используя для иммунизации животных высокоочищенные антигены,

2) очищая нативные сыворотки от антител нежелательной специфичности.

Для этого используют:

1) иммуноаффинный метод, в основе которого лежит связывание антител определенной специфичности соответствующими антигенами, иммобилизованными на твердофазном носителе, с последующим разделением образовавшихся комплексов АГ -АТ и выделением антител;

2) метод адсорбции по Кастеллани. Для этой цели к нативной иммунной сыворотке, содержащей группоспецифические перекрестно реагирующие антитела, последовательно добавляют микроорганизмы, в состав которых входят все групповые антигены, адсорбируя таким образом гомологичные анти-

тела. Такие адсорбированные моноспецифические антисыворотки содержат антитела к различным детерминантам молекулы антигена, которые гетерогенны по классовой (подклассовой)

61. Реакции с участием комплемента. Реакция связывания комплемента. Механизм, компоненты, способы постановки, применение. Реакция радиального гемолиза

Реакции с участием комплемента

Реакции с участием комплемента основаны на активации комплемента комплексом анти­ген-антитело (реакция связывания компле­мента, радиального гемолиза и др.).

Реакция связывания комплемента (РСК ) за­ключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммун­ный комплекс, к которому через Fc -фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комп­лексом антиген-антитело. Если же комплекс антиген-антитело не образуется, то комп­лемент остается свободным (рис. 13.8). РСК проводят в две фазы: 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (инди­каторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемоли­тической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содер­жащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген-антите­ло происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизирован­ных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и ан­титело не соответствуют друг другу (в иссле­дуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - ан- тиэритроцитарное антитело, вызывая гемо­лиз; реакция отрицательная.

РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифи­лиса (реакция Вассермана).

Эту реакцию применяют для обнаружения антител в сыворотке крови больных при бактериальных, вирусных, протозойных инфекциях, а также для определения и типирования вирусов, выделенных у больных. РСК относится к сложным серологическим реакциям, в которых, кроме антигена, антитела и комплемента, участвует еще и гемолитическая система, выявляющая результаты реакции. РСК протекает в две фазы: первая - взаимодействие антигена с антителом при участии комплемента и вторая - выявление степени связывания комплемента при помощи гемолитической системы. Эта система состоит из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, полученной путем иммунизации лабораторных животных, эритроцитами. Эритроциты обрабатывают - сенсибилизируют, присоединяя к ним сыворотку при температуре 37°С, в течение 30 мин. Лизис сенсибилизированных эритроцитов барана наступает только в случае присоединения к гемолитической системе комплемента. В отсутствие его эритроциты не изменяются. Результаты РСК зависят от наличия в исследуемой сыворотке антител. Если сыворотка содержит антитела, гомологичные антигену, используемому в реакции, то образующийся комплекс антиген - антитело присоединяет, связывает комплемент. При добавлении гемолитической системы в этом случае гемолиза не произойдет, так как весь комплемент расходуется на специфическую связь комплекса антиген - антитело. Эритроциты остаются не измененными, поэтому отсутствие гемолиза в пробирке регистрируют как положительную РСК. При отсутствии в сыворотке антител, соответствующих антигену, специфический комплекс антиген - антитело не образуется и комплемент остается свободным. При добавлении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней и вызывает гемодиз эритроцитов. Разрушение эритроцитов, их гемолиз характеризует отрицательную реакцию.

Для постановки РСК необходимы: сыворотка больного, комплемент, гемолитическая система, состоящая из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, а также изотонический раствор хлорида натрия. Реакцию ставят в серологических пробирках. Эритроциты барана получают из дефибринированной крови барана путем троекратного отмывания их изотоническим раствором хлорида натрия. Гемолитическую сыворотку выпускают в готовом виде в ампулах, на этикетке которых указан ее титр, т. е. максимальное разведение сыворотки, которое еще вызывает гемолиз при добавлении к эритроцитам в присутствии комплемента. Гемолитическую сыворотку получают путем иммунизации животных, например кролика эритроцитами барана. При постановке реакции сыворотку используют в тройном титре. Например, титр гемолитической сыворотки 1: 1200, а рабочее разведение 1: 400. В качестве комплемента используют свежую сыворотку крови морской свинки (в течение 24-48 ч) или сухой комплемент в ампулах. Предварительно перед постановкой РСК комплемент разводят 1: 10 и титруют для установления титра - наименьшего количества комплемента, которое дает гемолиз эритроцитов при соединении с гемолитической системой, используемой в данной реакции. Учитывая возможные антикомплементарные свойства антигена, при постановке реакции к установленному рабочему титру комплемента делают 20-30% надбавку.
Антигеном для РСК являются взвеси убитых бактерий, экстракты, приготовленные из этих взвесей, отдельные химические фракции микробов. Основное требование к антигену - отсутствие угнетения активности комплемента. Он не должен обладать антикомплементарными свойствами. Для выявления этих свойств антигена комплемент дополнительно титруют в присутствии используемого в реакции антигена. Существуют определенные схемы постановки РСК. Результаты реакции учитывают по наличию или отсутствию гемолиза эритроцитов в гемолитической системе. РСК применяют при диагностике сифилиса (реакция Вассермана), гонореи (реакция Борде-Жангу), токсоплазмоза, риккетсиозных и вирусных заболеваний.

Реакцию радиального гемолиза (РРГ ) ставят в лунках геля из агара, содержащего эрит­роциты барана и комплемент. После внесе­ния в лунки геля гемолитической сыворотки (антител против эритроцитов барана) вокруг них (в результате радиальной диффузии анти­тел) образуется зона гемолиза. Таким образом можно определить активность комплемента и гемолитической сыворотки, а также антитела в сыворотке крови у больных гриппом, крас­нухой, клещевым энцефалитом. Для этого на эритроцитах адсорбируют соответствующие антигены вируса, а в лунки геля, содержащего данные эритроциты, добавляют сыворотку крови больного. Противовирусные антитела взаимодействуют с вирусными антигенами, адсорбированными на эритроцитах, после че­го к этому комплексу присоединяются ком­поненты комплемента, вызывая гемолиз.